Különbség a génklónozás és a PCR között

Fő különbség - génklónozás vs PCR
 

A DNS sok példányának szintézisét egy specifikus DNS-fragmensből DNS-amplifikációnak nevezzük. Két fő DNS-amplifikációs eljárás létezik, nevezetesen a génklónozás és a PCR. A legfontosabb különbség a génklónozás és a PCR között, A génklónozás egy adott gén több példányát hozza létre in vivo rekombináns DNS felépítésével és egy gazda baktériumban történő növesztéssel, miközben a PCR milliónyi példányban állít elő egy specifikus DNS-fragmenst in vitro ismétlődő denaturációs és szintézis ciklusokon megy keresztül.

TARTALOMJEGYZÉK
1. Áttekintés és a legfontosabb különbség
2. Mi a génklónozás?
3. Mi a PCR?
4. Side by side összehasonlítás - génklónozás vs PCR
5. Összegzés

Mi a gén-klónozás??

A génklónozás egy módszer, amelyet egy specifikus gén lokalizálására és szaporítására egy organizmus extrahált genomiális DNS-éből rekombináns DNS felépítésével végeznek. A genomi DNS több ezer különböző gént tartalmaz, amelyek fehérjékre vannak kódolva. Amikor a DNS-t extrahálják, az magában foglalja az összes lehetséges gént, amelyet képes viselni. A génklónozási technika lehetővé tette egy specifikus gén kimutatását a teljes DNS-ből. Ezért a génklónozás fontos eszközként szolgál a molekuláris biológiában.

Egy szervezet genomkönyvtárának elkészítése elengedhetetlen a génklónozáshoz, ha nincs értelme a releváns génnek a DNS-ben való elhelyezkedéséről. A genomi könyvtárat a következő lépésekkel készítjük el.

1. lépés: A teljes DNS extrahálása egy olyan organizmusból, amely a kívánt gént tartalmazza.

2. lépés: Az extrahált DNS korlátozott emésztése kis kezelhető fragmensek előállítása céljából. Ezt a lépést megkönnyítik a restrikciós endonukleázok.

3. lépés: Megfelelő vektor kiválasztása és a vektor DNS megnyitása ugyanazon restrikciós endonukleázok felhasználásával. A baktérium-plazmidokat általában vektorokként használják idegen DNS hordozására. A plazmidok a DNS kicsi körei, amelyek a baktériumokon belül helyezkednek el.

4. lépés: A vektor-DNS és a fragmentált DNS kombinálása rekombináns DNS-molekula előállítására. Ezt a lépést a DNS-ligáz szabályozza.

5. lépés: Rekombináns DNS-molekulák átvitele gazda baktériumokba. Ezt a lépést transzformációnak nevezik, és hő-sokkkal hajtják végre.

5. lépés: A transzformált baktériumsejtek szkrínelése táptalajon. A transzformált és nem transzformált gazdasejtek vegyes populációját kapjuk a transzformációs folyamat végén. Mivel az érdekes gén csak a transzformált gazdasejtekben terjed ki. Ezért ki kell választani a transzformált sejteket. A kiválasztást szelektív tápközeggel végezzük, amely antibiotikumokat tartalmaz. Csak a transzformált sejtek nőnek ezen a szűrőközegen, lehetővé téve a szelekciót.

6. lépés: Baktériumok szaporítása génkönyvtár létrehozása céljából. Ebben a lépésben a transzformált gazdasejteket friss tenyésztő tápközegbe vezetjük, amely optimális növekedési követelményeket biztosít. A tenyészlemezeken lévő összes kolónia képviseli ennek a szervezetnek a genomiális könyvtárát.

7. lépés: A kérdéses gént tartalmazó rekombináns DNS-molekulát át kell szűrni a rekombináns DNS több ezer klónozott fragmentumából. Ez megvalósítható olyan próbák alkalmazásával, amelyek megjelölik a specifikus gént, vagy az adott génből származó specifikus fehérje.

Miután a baktériumtelepet tartalmazó érdekelt gént azonosították a teljes kolóniákból, lehetséges milliókat lemásolni a gént tartalmazó rekombináns plazmidról.

A génklónozást génkönyvtárak létrehozására, speciális fehérjék, vitaminok, antibiotikumok, hormonok előállítására, a szervezetek genomjainak szekvenálására és feltérképezésére, az egyes DNS-ek több példányának másolatainak készítésére kriminalisztikában stb..

Ábra: Génklónozás

Mi a PCR??

A polimeráz láncreakció (PCR) egy olyan módszer, amely egy adott DNS-fragmens nagyszámú másolatát generálja. Egy specifikus DNS-szekvencia exponenciális amplifikációját PCR-rel végezzük in vitro körülmények. Ez a technika nagyon hatékony eszköz a molekuláris biológiában, mivel egy kis DNS-mintát felhasználható mennyiségre képes szaporítani. A PCR-t Kary Mullis vezette be 1983-ban, és ez a díjnyertes találmány hatalmas előrelépést hozott a molekuláris biológiában..

A PCR-technika az ismételt PCR-reakciókat követi, a 02. ábrán bemutatottak szerint. Egy PCR-reakció három fő lépésből áll, amelyek három különböző hőmérsékleten játszódnak le; a kettős szálú DNS denaturálása 94 ° C-on ⁰C, a primerek lágyítása 68 ° C-on ⁰C és szálhosszabbítás 72 ° C-on ⁰C. Ezért a PCR elvégzésekor a megfelelő replikáció érdekében a hőmérsékleti ingadozást nagymértékben fenn kell tartani. A PCR-t egy PCR-gépen hajtják végre a PCR-csövekben. A PCR csöveket megfelelő PCR keverékekkel töltjük be, amelyek templát DNS-t, Taq polimerázt, primereket, dNTP-ket és puffert tartalmaznak. A kettős szálú minta DNS denaturálását egyszálú DNS-ként úgy végezzük, hogy a komplementer bázisok közötti hidrogénkötéseket 94–98 ° C-on megbontjuk. ⁰C. Ezután a templát-DNS egyszálú részeit ki lehet deríteni a primerek számára. Pár alapozót (előre és hátra) kell biztosítani, és hőstabilnak kell lenniük, hogy elviseljék a magas hőmérsékletet. A primerek egyszálú rövid DNS-szekvenciák, amelyek a cél-DNS-fragmens végeivel komplementer. Szintetikus primereket használunk a PCR-ben. A primerek kötődnek a minta DNS komplementer bázisaihoz és új szál szintetizálását kezdeményezik. Ezt a lépést egy Taq polimeráz nevű enzim katalizálja; egy hőstabil DNS polimeráz enzim, amely izolálva van Thermus auqaticus. Ha primerek és nukleotidok (építőelemek) állnak rendelkezésre, a Taq polimeráz a DNS új szálát építi fel, kiegészítve a templát DNS-t. A PCR program végén gélelektroforézissel megfigyeltük az amplifikált DNS fragmentumot. Ha további elemzésre van szükség, a PCR-terméket tisztítják a gélből.

A PCR nagyon hasznos a genetikai és szerzett betegségek diagnosztizálásában és monitorozásában, a bűnözők azonosításában (a kriminalisztika területén), a célzott DNS szegmens szerkezetének és működésének tanulmányozásában, az organizmusok genomjainak szekvenálásában és feltérképezésében stb. rutin laboratóriumi technika az orvos- és molekuláris biológiai kutató laboratóriumokban a tudósok körében, mivel széles körű alkalmazási lehetőségekkel rendelkezik.

Ábra: Polimeráz láncreakció

Mi a különbség a génklónozás és a PCR között??

Gén klónozás vs PCR
A génklónozás egy adott gén több példányának elkészítésének folyamata in vivo rekombináns DNS-en keresztül, és gazda baktériummá transzformálódik.	A PCR technika egy adott DNS-szekvencia több példányát hozza létre in vitro a PCR reakciók ismételt ciklusaival.
A rekombináns DNS előállításának követelménye
A gén lokalizálásához rekombináns DNS-t állítunk elő.	Rekombináns DNS-t nem termelnek.
Munkaerő
Ez a folyamat munkaigényes.	Intenzív munkavégzésre nincs szükség.
In vivo vagy in vitro eljárás
A rekombináns DNS felépítése: in vitro és a DNS amplifikációja in vivo.	A DNS amplifikációja teljes mértékben megtörténik in vitro.

Összegzés - génklónozás vs PCR

A génklónozás és a PCR két módszer a DNS amplifikációhoz. A PCR egy in vitro eljárás, amely egy adott DNS-fragmens DNS-éből többszörözi másolatot, rekombináns DNS és gazdaszervezet nélkül. A génklónozás elsősorban egy in vivo olyan folyamat, amelynek során az érdekelt gén több példányát kapja meg a gazdaszervezetben rekombináns DNS felépítése útján. Ez a különbség a génklónozás és a PCR között.

Referencia:
1. Griffiths, Anthony JF. "Egy adott gén klónozása." Modern genetikai elemzés. Amerikai Egyesült Államok Nemzeti Orvostudományi Könyvtára, 1999. január 1. Web. 2017. február 22
2. „Polimeráz láncreakció (PCR).” Országos Biotechnológiai Információs Központ. Az Egyesült Államok Nemzeti Orvostudományi Könyvtára, n.d. Web. 2017. február 22

Kép jóvoltából:
1. „17 01 06 ábra” - a CNX OpenStax - (CC BY 4.0) segítségével a Commons Wikimedia-on keresztül
2. Madprime „PCR” - Saját munkája (CC BY-SA 3.0) a Commons Wikimedia segítségével