Különbség a Sanger szekvenálás és a pirosekvenálás között

Legfontosabb különbség - Sanger szekvenálás vs Pyrosequencing
 

A DNS-szekvenálás nagyon fontos a DNS-elemzés szempontjából, mivel egy adott DNS-régióban a helyes nukleotid-elrendezés ismerete sok fontos információt derít fel róla. Különböző DNS-szekvenálási módszerek léteznek. A Sanger szekvenálás és a pirosekvenálás két különféle DNS szekvenálási módszer, amelyeket széles körben használnak a molekuláris biológiában. A legfontosabb különbség a Sanger szekvenálás és a pirosekvenálás között az A Sanger-szekvenálás nagyoxi-nukleotidokat használ a DNS szintézisének befejezéséhez a nukleotidszekvencia leolvasására, míg a pirosekvenálás a nukleotidok beépítésével és a komplementer szekvencia szintetizálásával a nukleotidok beépítésével kimutatja a pirofoszfát felszabadulását a szekvencia pontos sorrendjének leolvasása céljából..

TARTALOMJEGYZÉK
1. Áttekintés és a legfontosabb különbség
2. Mi a Sanger szekvenálás?
3. Mi a pirosequencing?
4. Összehasonlítás egymással - Sanger szekvenálás vs. pirosekvenálás
5. Összegzés

Mi a Sanger szekvenálás??

A Sanger szekvenálás egy első generációs DNS szekvenálási módszer, melyet Frederick Sanger és kollégái fejlesztettek ki 1977-ben. A lánc lezárásának szekvenálása vagy Dideoxi szekvenálás mivel a dideoxinukleotidok (ddNTP-k) általi lánctermináción alapszik. Ezt a módszert széles körben alkalmazták több mint 30 évig, amíg kifejlesztik az új generációs szekvenálást (NGS). A Sanger szekvenálási technika lehetővé tette a helyes nukleotid-sorrend felfedezését vagy egy adott DNS-fragmens kapcsolódását. A ddNTP-k szelektív beépítésén és a DNS-szintézis befejezésén alapul in vitro DNS replikáció. A szomszédos nukleotidok közötti foszfodiészter-kötés folytatódásának 3 'OH-csoportjainak hiánya a ddNTP-k egyedi jellemzője. Ennélfogva, amikor a ddNTP csatlakozik, a lánc meghosszabbodása leáll, és ettől a ponttól megszűnik. Négy ddNTP-t - ddATP, ddCTP, ddGTP és ddTTP - használnak a Sanger-szekvenálásban. Ezek a nukleotidok megállítják a DNS replikációs folyamatát, amikor beépülnek a növekvő DNS-szálba, és változó hosszúságú rövid DNS-t eredményeznek. Kapilláris gélelektroforézist alkalmaznak ezeknek a rövid DNS-szálaknak méret szerinti méretű megszervezésére gélen, amint azt a 01. ábra mutatja..

1. ábra: Szintetizált rövid DNS kapilláris gél elektroforézise

mert in vitro DNS replikációja, kevés követelményt kell előírni. Ezek DNS polimeráz enzim, templát DNS, oligonukleotid primerek és deoxinukleotidok (dNTP-k). A Sanger-szekvenálás során a DNS replikációt négy különálló kémcsőben hajtják végre, külön-külön négyféle ddNTP-vel együtt. A deoxinukleotidokat nem helyettesítik teljesen a megfelelő ddNTP-k. Az adott dNTP keverékét (például dATP + ddATP) belevisszük a csőbe és megismételjük. Négy különálló csőterméket gélen futtatunk négy különálló lyukban. Ezután a gél leolvasásával a szekvencia a 02. ábrán bemutatott módon állítható elő.

02 ábra: Sanger szekvenálás

A Sanger-szekvenálás fontos technika, amely a molekuláris biológia sok területén segít. Az emberi genom projektet Sanger szekvenálás-alapú módszerek segítségével sikeresen befejezték. A Sanger-szekvenálás a cél-DNS-szekvenálásban, a rákos és genetikai betegségek kutatásában, a gén expressziós elemzésében, az emberi azonosításban, a kórokozó kimutatásában, a mikrobiális szekvenálásban stb..

A Sanger-szekvenálásnak számos hátránya van:

• A szekvenálandó DNS hossza nem lehet hosszabb, mint 1000 bázispár
• Egyszerre csak egy szál szekvenálható.
• A folyamat időigényes és költséges.

Ezért új, fejlett szekvenálási technikákat dolgoztak ki idővel e problémák leküzdésére. A Sanger szekvenálás azonban továbbra is használatban van, a nagyon pontos eredmények miatt, kb. 850 bázispár hosszúságú fragmensekig.

Mi a pirosequencing??

A pirosekvenálás egy új DNS-szekvenálási technika, amely a „szintézissel történő szekvenáláson” alapul. Ez a technika a pirofoszfát felszabadulásának kimutatására épül, a nukleotid beépülésekor. A folyamatot négy különböző enzim alkalmazza: DNS-polimer, ATP-szulfuriláz, luciferáz és apyrase és két szubsztrát az adenozin 5 'foszfoszulfát (APS) és a luciferin.

A folyamat azzal indul, hogy a primer kötődik az egyszálú DNS-templáthoz, és a DNS-polimeráz megkezdi a komplementer nukleotidok beépülését. Amikor a nukleotidok összekapcsolódnak (nukleinsav polimerizáció), akkor felszabadítják a pirofoszfát (két foszfát csoport, amely egymáshoz kapcsolódik) csoportokat és energiát. Az egyes nukleotid-addíciók ekvimoláris mennyiségű pirofoszfátot szabadítanak fel. A pirofoszfát ATP-szulfurilázzá alakul ATP-vel szubsztrát APS jelenlétében. A képződött ATP megkönnyíti a luciferáz közvetítésével a luciferin oxiluciferinné történő átalakulását, látható fényt termelve az ATP-k mennyiségével arányos mennyiségben. A fényt fotonérzékelő készülék vagy fényszorzó segítségével érzékeli, és ezzel pirrogramot hoz létre. Az Apyrase lebontja az ATP-t és a nem beépített dNTP-ket a reakcióelegyben. A dNTP hozzáadása egyszerre történik. Mivel a nukleotid hozzáadása a fény beépülése és kimutatása szerint ismert, a templát szekvenciája meghatározható. A pyrogramot használjuk a minta DNS nukleotidszekvenciájának előállítására, ahogy a 03. ábrán látható.

A pirosekvenálás nagyon fontos az egy nukleotidos polimorfizmus elemzésében és a rövid DNS szakaszok szekvenálásában. A nagy pontosság, rugalmasság, az automatizálás egyszerűsége és a párhuzamos feldolgozás előnyei a pirosequencing a Sanger szekvenálási technikákkal szemben.

03. ábra: Pirosquencing

Mi a különbség a Sanger Sequencing és a Pyrosequencing között??

Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
A Sanger-szekvenálás egy olyan DNS-szekvenálási módszer, amely a ddNTP-k szelektív beépítésén és a DNS-polimerázon alapul, és láncterminálással.	A pirozekvenálás egy DNS-szekvenálási módszer, amelynek alapja a pirofoszfát felszabadulásának kimutatása nukleotid beépülésekor.
A ddNTP használata
A ddNTP-ket használják a DNS replikáció befejezéséhez	A ddNTP-ket nem használják.
Az érintett enzimek
DNS-polimerázt alkalmazunk.	Négy enzimet használunk: DNS-polimeráz, ATP-szulfuriláz, Luciferáz és Apiráz.
Használt hordozók
Az APS-t és a Luciferint nem használják.	Az adenozin 5 'foszfoszulfátot (APS) és a luciferint használjuk.
Maximális hőmérséklet
Ez egy lassú folyamat.	Ez egy gyors folyamat.

Összegzés - Sanger szekvenálás vs. pirosekvenálás

A Sanger szekvenálás és a pirosekvenálás két molekuláris biológiában alkalmazott DNS szekvenálási módszer. A Sanger szekvenálás a nukleotidok sorrendjét állítja össze a lánc meghosszabbításának megszakításával, míg a pirosekvenálás a nukleotidok pontos sorrendjét hozza létre a nukleotidok beépítésével és a pirofoszfátok felszabadításának detektálásával. Ezért a Sanger-szekvenálás és a pirosekvenálás közötti fő különbség az, hogy a Sanger-szekvenálás a szekvenálással működik lánc-végzéssel, míg a pirosekvenálás a szintetikus szekvenálással működik..

Referencia:
1. Fakruddin, Md és Abhijit Chowdhury. „Pirosquencing - alternatívája a hagyományos Sanger-szekvenálásnak.” American Journal of Biochemistry and Biotechnology. Tudományos publikációk, 2012. március 2. Web. 2017. február 28.
2. „Sanger szekvenálás”. Sanger szekvenálás - ScienceDirect témák. N.p., n.d. Web. 2017. február 28

Kép jóvoltából:
1. Christoph Goemans (modifiziert) „Didezoxi-módszer” - Dr. Norman Mauder, az alapvető einer Datei von Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) a Commons Wikimedia segítségével
2. „Sanger-DNA-seq” Enzo által a lengyel nyelvű Wikipedia-ban (CC BY-SA 3.0) a Commons Wikimedia segítségével
3. „Pirosquencing” mikrobiológiai byte-ban (CC BY-SA 2.0) a Flickr-en keresztül