Különbség a PCR és a DNS szekvenálás között

Fő különbség - PCR vs. DNS szekvenálás
 

A PCR és a DNS szekvenálás két fontos technika a molekuláris biológiában. A polimeráz láncreakció (PCR) az a folyamat, amely nagyszámú másolatot hoz létre egy DNS-fragmensből. A DNS-szekvenálás olyan módszer, amely az adott DNS-fragmens nukleotidjainak pontos sorrendjét eredményezi. Ez a legfontosabb különbség a PCR és a DNS szekvenálás között. A PCR az egyik legfontosabb lépés a DNS szekvenálásában.

TARTALOMJEGYZÉK
1. Áttekintés és a legfontosabb különbség
2. Mi a PCR?
3. Mi a DNS-szekvenálás?
4. Side by side összehasonlítás - PCR vs. DNS szekvenálás
5. Összegzés

Mi a PCR??

A polimeráz láncreakció (PCR) egy DNS amplifikációs módszer, amelyet a molekuláris biológiában alkalmaznak. Egy adott DNS-fragmens több ezer-millió példányát állítja elő. Ezt a módszert Kary Mullis fejlesztette ki 1983-ban. Ebben a technikában az amplifikálandó DNS fragmentuma templátként szolgál, és a DNS polimeráz enzim komplementer nukleotidokat ad a primerhez, amely a PCR keverékben rendelkezésre áll. A PCR reakció végén a minta DNS sok példányát szintetizálják.

A PCR keveréknek különféle komponensei vannak, beleértve a DNS-t, a DNS-polimerázt (Taq-polimeráz), a primereket (előre és fordított primerek), nukleotidokat (a DNS építőelemei) és egy puffert. A PCR egy PCR gépen belül történik, a helyes PCR keveréket be kell tölteni a gépbe, és a helyes programot kell vezetni. Ez a technika lehetővé teszi egy nagyon egyedülálló mennyiségű DNS egy adott DNS szakaszának ezer-millió példányban történő előállítását.

A PCR reakciók ciklikus módon zajlanak, hogy a PCR termékek látható mennyiségét előállítsák egy gélen. A PCR reakcióban három fő lépés van, nevezetesen a 01. ábrán látható denaturálás, primer lágyítás és szálhosszabbítás. Ez a három lépés három különböző hőmérsékleten zajlik le. A DNS kettős szálú formában létezik hidrogénkötésekkel a komplementer bázisok között. Az implikáció előtt a kettős szálú DNS-t el kell választani egymástól. Ezt úgy végezzük, hogy magas hőmérsékletet adunk hozzá. Magas hőmérsékleten a kétszálú DNS denaturálódik egyszálúvá. Ezután a primereknek közelebb kell állniuk a specifikus fragmens vagy a DNS génje szomszédos végeihez. A primer az egyszálú DNS rövid darabja, amely komplementer a célszekvenciával. Az előre- és fordított primerek a denaturált minta-DNS szélső végén lévő komplementer bázisokkal hevítik a lágyítási hőmérsékletet. Az alapozóknak hőállóaknak kell lenniük. Miután a primerek a DNS-sel megfertőződtek, a taq polimeráz enzim megindítja az új szálak szintézisét olyan nukleotidok hozzáadásával, amelyek a cél DNS-éhez komplementerek. A Taq polimeráz egy hőstabil enzim, amelyet egy, az úgynevezett termofil baktériumból izolálnak Thermus aquaticus. A PCR puffer fenntartja a taq polimeráz hatásának optimális feltételeit. A PCR reakciók három szakaszát megismételjük, hogy előállítsuk a szükséges mennyiségű PCR terméket. Minden PCR reakció után a DNS-kópia száma megkétszereződik. Ezért exponenciális amplifikáció megfigyelhető a PCR-ben. A PCR-termékek megfigyelhetők gélelektroforézissel és tisztíthatók további vizsgálatok céljából.

01. ábra: A PCR-reakció fő lépései

A PCR értékes eszköz az orvosi és biológiai kutatásokban. A PCR különös jelentőséggel bír a kriminalisztika területén, mivel képes amplifikálni a DNS-t a bűnözők apró mintáiból származó vizsgálatokhoz és kriminalisztikai DNS-profilokat készíteni. A PCR-t széles körben használják a molekuláris biológia számos területén, ideértve a genotipizálást, a génklónozást, a mutáció kimutatását, a DNS szekvenálást, a DNS mikrotáblákat és az apasági tesztet stb..

02 ábra: Polimeráz láncreakció

Mi a DNS szekvenálás??

A DNS-szekvenálás a nukleotidok - az adenin, guanin, citozin és a timin - pontos sorrendjének meghatározása egy adott DNS-fragmentumban. A genetikai információt a DNS-szekvenciákban a nukleotidok megfelelő sorrendjében tárolják. Ezért nagyon fontos, hogy a nukleotidok pontos sorrendjét megtaláljuk egy DNS-fragmensben, hogy megismerjük a gének szerkezetét és működését.

A DNS szekvenálási protokoll különböző folyamatokat foglal magában. Az első lépés az érdekelt DNS vagy a szervezet genomiális DNS-ének izolálása. PCR alkalmazásával (a fent leírtak szerint) a DNS kívánt régióját meg kell sokszorozni. Az amplifikált PCR-terméket elválasztjuk a gélelektroforézissel és tisztítjuk. Az amplifikált fragmenseket sablonokként szolgáljuk a szekvenáláshoz. A szekvenálás elvégezhető Sanger szekvenálás vagy nagy teljesítményű szekvenálás módszerrel. A Sanger-szekvenáláshoz a kapott DNS-fragmentumok kapilláris elektroforézisét kell elvégezni. A helyes nukleotid sorrend meghatározását az autoradiográfok kézi leolvasásával vagy automatizált DNS-szekvenciákkal lehet elvégezni.

A génszekvenálás hozzájárult az emberi genomprojekthez és megkönnyítette a humán genom feltérképezését 2003-ban. A kriminalisztika során a DNS-szekvenálás lehetővé tette az egyedi DNS-szekvenciákat mutató és a bűnözők azonosítását lehetővé tevő egyének azonosítását. Az orvostudományban a DNS-szekvenálás segítségével felismerhetők a genetikai és egyéb betegségekért felelős gének, meg lehet találni hibagéneket, és helyettesíthetők a helyes génekkel. A mezőgazdaságban néhány mikroorganizmus DNS-szekvenálási információját használják gazdaságilag kívánt tulajdonságokkal rendelkező transzgenikus növények előállításához.

03. ábra: DNS-szekvenálás

Mi a különbség a PCR és a DNS szekvenálás között??

PCR vs. DNS szekvenálás
A PCR-folyamat ezer-millió példányban hozza létre az érdekelt DNS-fragmenst.	A DNS-szekvenálás a nukleotidok pontos sorrendjének meghatározása egy adott DNS-fragmensben.
Eredmény
A PCR egy adott DNS-fragmens több ezer-millió példányát hozza létre	Ez a bázisok helyes sorrendjét eredményezi egy adott DNS-fragmentumban.
A ddNTP-k bevonása
A PCR nem igényel ddNTP-ket. DNTP-ket használ.	A DNS-szekvenáláshoz ddNTP-k szükségesek a szálképződés megszüntetéséhez.

Összegzés - PCR vs. DNS szekvenálás

A PCR és a DNS szekvenálás nagyon fontos eszköz a molekuláris biológia számos területén. A DNS-fragmensek amplifikálását PCR módszerrel hajtjuk végre, míg a DNS-fragmens nukleotidjainak helyes sorrendjét a DNS-szekvenálás határozza meg. Ez a különbség a PCR és a DNS szekvenálás között.

Referencia:
1. “Polimeráz láncreakció (PCR).” Országos Biotechnológiai Információs Központ. Az Egyesült Államok Nemzeti Orvostudományi Könyvtára, n.d. Web. 2017. február 21.
2. Shendure, Jay és Hanlee Ji. "A következő generációs DNS-szekvenálás." Természet Hírek. Nature Publishing Group, 2008. október 9. Web. 2017. február 21

Kép jóvoltából:
1. Tinojasontran „PCR lépések” - Saját munkája (Public Domain) a Commons Wikimedia segítségével
2. Enzoklop „Polimeráz láncreakció” - Saját munka (CC BY-SA 3.0) a Commons Wikimedia segítségével
3. „DNS-szekvencia” Sjef által - Saját munka (Public Domain) a Commons Wikimedia-on keresztül